Добрый день, уважаемые друзья! Итак, сегодня речь вновь пойдет о важной составляющей для здоровья человека – его иммунитете.

Конечно, все мы понимаем, что необходимо следить за здоровьем, и каждый из нас неоднократно слышал и сам произносил эту фразу – повышение иммунитета. Сегодня нашей темой станет одна из сторон данного вопроса, а именно, что такое гуморальный иммунитет?

Этот термин особенно часто приходится слышать в медицинских учреждениях. Попробуем и мы понять, что это значит, и как это работает. Классификация видов защитной системы человека довольно обширна, и включает в себя нескольких пунктов.

Гуморальные факторы иммунитета, выражаясь простыми словами, это постоянная выработка антител, призванных уничтожать патогенные вирусы и инфекционные проявления. Противостояние должно быть постоянным, только так можно сохранить здоровье и предотвратить опасные болезни. Иммунитет человека, это звено, которое не должно быть слабым.

В связи с данным типом защитной системы, нельзя не упомянуть о втором виде, который несколько отличается по своему функционалу, но неразрывно связан с вышеупомянутым. Это клеточный вид защитной системы. Вместе они позволяют достигнуть отличного эффекта. В чём различия между клеточным и гуморальным иммуннозащитным действием?

• Клеточный имеет способность распознавать и поражать грибы, вирусы, чужеродные клетки и ткани в собственных клеточных структурах.
• Гуморальная теория иммунитета связана с поражением бактерий находящихся в околоклеточном пространстве, и главным образом в составе плазмы.

В основе теории заложены процессы специфического взаимодействия антител. Основа иммунитета В – лимфоциты, синтезированные с родными белками, способны моментально реагировать на появление чужеродных белков.

При этом, как только в крови намечается появление инородного вещества, даже независимо от его вредности, тут же образуются антитела. А такая реакция способна вызвать поражение «чужеземца» без особых усилий.

То есть, чтобы совсем было понятно, механизм действия прост, защиту нашей крови и клеток при гуморальном иммунитете, осуществляют белки антигены. Они входят в кровяной состав и другие жидкости нашего с вами организма.

Гуморальный иммунитет – это распознание бактерий в любой жидкости организма, будь то кровь, лимфа, слюна или другая. Название «гуморальный» и есть жидкость, влага. При повсеместном образовании антител или иммуноглобулинов, будь то костный мозг, лимфоузлы или кишечник, белковые соединения «липнут» к инородным бактериальным структурам. Успешно разрушают их, выводя затем из организма с той же жидкостью. Существует пять основных типов иммуноглобулинов:

А, D, Е, G, M. От всех, имеющихся в нас лимфоцитов, их определяется в организме порядка 15%.

Немного истории

История изучения гуморального звена иммунитета уходит в те годы, когда в 19 веке возник спор между двумя выдающимися учеными Ильей Мечниковым и Паулем Эрлихом. В то время не уделялось столько внимания вопросу иммунитета и люди страдали от постоянных тяжелых заболеваний и инфекционных поражений.

На основе этой трудноразрешимой задачи и сошлись в споре мнения учёных мужей. Доказательства Мечникова были основаны на том, что иммунные свойства организма человека работают исключительно на уровне клеточных процессов. То есть клетки основа основ иммунитета.

Эрлих спорил со своим оппонентом и доказывал, что плазма крови есть основной двигатель защитных процессов, и именно от ее состава зависит иммунитет. Так длилось много лет, и никто из них не стал победителем важного спора, вернее, они оба оказались победителями и получили по Нобелевской премии.

Вот такая правдивая история из жизни великих ученых, позволившая путем долгого исследования сделать важное открытие. Считается, что гуморальный иммунитет открыл П. Эрлих.

Получилось, что один доказывал преимущества клеточного иммунитета, а другой гуморального. Итог спора нам известен, обе защитные системы имеют для человека огромное значение и тесно взаимосвязаны друг с другом. Регулировка защитных процессов происходит в двух системах, клеточной и молекулярной.

Только за счёт взаимодействия этого симбиоза возникло многоклеточное существо, способное противостоять бесконечным атакам вирусов и патогенных микробов. И имя этому существу Человек. Наша уникальная система позволила нам выжить и пройти сквозь тысячелетия, постоянно адаптируясь к среде обитания.

Гуморальный специфический и неспецифический иммунитет

Все мы реагируем по – разному на внешние негативные факторы, способные вызвать заболевания. Одни начинают хандрить и испытывать признаки болезни от малейшего дуновения ветерка, другие могут выдержать ледяную прорубь. Всё это механизм действия защитного фона.

Сегодня работу человеческого тела, медики классифицируют как специфическую и неспецифическую. Давайте разберем подробнее каждое из понятий.

• Специфическая реакция или форма направляется на какой – либо одиночный фактор. Примером может послужить человек, переболевший будучи ребёнком ветряной оспой, после чего, у него выстроился стойкий иммунитет на данное заболевание. Сюда же можно включить все те прививки и вакцинации, которые нам были сделаны в детском возрасте.
• Неспецифическая форма подразумевает универсальную защиту, данную природой и реакцию организма на проникновение в организм инфекции.

Давайте рассмотрим принцип действия этих двух форм более детально.

К факторам специфического свойства, прежде всего, принадлежат иммуноглобулины или антитела. Ими занимаются в крови белые клетки, иначе их можно назвать В – лимфоцитами. Как вырабатываются антитела в организме?

Первая часть всегда появляется путем передачи при рождении от матери, вторая через грудное молоко. Проходит время, и человек становится способен сам вырабатывать их из стволовых клеток или после воздействия вакцины.

К неспецифическим факторам относятся вещества без четкой специализации, это: тканевые частицы организма, кровяная сыворотка и белки в ней, железы и их секреторная способность подавлять рост микробов, лизоцим, содержащий в себе антибактериальный фермент.

Гуморальное звено иммунитета играет важную роль и в том и в другом случае и выстраивается постоянным образованием во внутренних системах организма «умных» антител.

Нарушения

Методы изучения позволяют выявить нарушения в гуморальном иммунитете. Это делается при помощи специального анализа – иммунограммы. Данное обследование позволяет понять количество находящихся в организме В – лимфоцитов, иммуноглобулинов, показатель интерферона и другие важные параметры.

Этот анализ проводится путем забора крови из вены. Делается это натощак утром, так, чтобы до этого было 8 часов воздержания от пищи, алкоголя и курения.

Всё это довольно трудные понятия для восприятия обычным человеком, скорее это прерогатива специалистов. Но все же, интересно понять принцип действия иммунитета и немного расширить свой кругозор в этом вопросе. Не забывайте поддерживать свой организм, и помните, от состояния гуморального иммунитета зависит ваше здоровье!

Существуют две ветви приобретенного иммунитета с разным составом участников и различным предназначением, но имеющие одну общую цель - устранение антигена. Как мы увидим в дальнейшем, эти две ветви взаимодействуют друг с другом, чтобы достичь конечной цели - устранения антигена.

Из этих двух направлений приобретенного иммунного ответа одно определяется участием в основном В-клеток и циркулирующих антител, в форме так называемого гуморального иммунитета (термин «гуморальный» ранее использовали для определения жидких сред организма). Другое направление определяется участием Т-клеток, которые, как мы указывали ранее, не синтезируют антител, но синтезируют и высвобождают различные цитокины, действующие на другие клетки. В связи с этим данный вид приобретенного иммунного ответа называется клеточным или клеточно-опосредованным иммунитетом.

Гуморальный иммунитет

После связывания антигена В-клетка получает сигналы на производство секретируемой формы того иммуноглобулина, который ранее был представлен в мембранной форме. Процесс инициации полномасштабной реакции с участием антител направлен на удаление антигена из организма. Антитела представляют собой гетерогенную смесь сывороточных глобулинов, которые обладают способностью самостоятельно связываться со специфичными антигенами. Все сывороточные глобулины со свойствами антител относят к иммуноглобулинам.

Все молекулы иммуноглобулинов имеют общие структурные свойства, которые позволяют им: 1) распознавать и специфически связываться с уникальными элементами структуры антигена (т.е. эпитопами); 2) выполнять общую биологическую функцию после соединения с антигеном. В основном, каждая молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных легких (L) и двух тяжелых (Н) цепей, связанных дисульфидными мостиками. Получающаяся в результате структура показана на рис. 1.2.

Рис. 1.2. Типичная молекула антитела, состоящая из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей. Выделены антигенсвязывающие участки

Часть молекулы, которая связывается с антигеном, является зоной, состоящей из терминальных участков аминокислотных последовательностей как на L-, так и на Н-цепях. Таким образом, каждая молекула иммуноглобулина является симметричной и способна связываться с двумя идентичными эпитопами, имеющимися на одной молекуле антигена или на разных молекулах.

Кроме различий между участками, связывающими антиген, у разных молекул иммуноглобулина имеются и другие различия, наиболее важные из которых касаются Н-цепей. Существует пять основных классов Н-цепей (называемых у, μ, α, ε и δ).

На основании различий в Н-цепях молекулы иммуноглобулина были разделены на пять основных классов: IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, каждый из которых характеризуется уникальными биологическими свойствами. Например, IgG является единственным классом иммуноглобулинов, пересекающим плацентарный барьер и передающим материнский иммунитет плоду, в то время как IgA - основной иммуноглобулин, обнаруживаемый в таких секретах желез, как слеза или слюна.

Важно отметить, что антитела всех пяти классов могут обладать совершенно одинаковой специфичностью по отношению к антигену (антигенсвязывающие участки), сохраняя в то же время различные функциональные (биологические эффекторные) свойства.

Связь между антигеном и антителом нековалентная, она зависит от множества относительно слабых сил, таких как водородные связи, вандерваальсовы силы и гидрофобные взаимодействия. Поскольку эти силы слабы, для успешного связывания антигена с антителом требуется очень близкий контакт на ограниченном участке, наподобие контакта ключа и замка.

Другим важным элементом гуморального иммунитета является система комплемента . Реакция между антигеном и антителом активирует комплемент, который составляют ряд сывороточных ферментов, что приводит или к лизису мишени, или усиливает фагоцитоз (поглощение антигена) клетками-фагоцитами. Активация комплемента также приводит к привлечению полиморфно-ядерных (ПМЯ) клеток , обладающих высокой способностью к фагоцитозу и являющихся частью врожденной иммунной системы. Эти события обеспечивают максимально эффективный ответ гуморальной ветви иммунитета на вторжение чужеродных агентов.

Клеточно-опосредованный иммунитет

Рис. 1.3. Рецепторы для антигена, экспрессируемые как трасмембранные молекулы на В- и Т-лимфоцитах

Существует несколько различающихся по фенотипу субпопуляций Т-клеток, каждая из которых может обладать одинаковой специфичностью по отношению к антигенной детерминанте (эпитопу), но при этом выполнять различные функции. В данном случае можно провести аналогию с разными классами молекул иммуноглобулинов, которые обладают одинаковой специфичностью, но различными биологическими функциями. Имеются две субпопуляции Т-клеток: Т-клетки-хелперы (Тн-клетки), которые экспрессируют молекулы CD4, и цитотоксические Т-клетки (Тс-клетки), которые экспрессируют молекулы CD8 на своей поверхности.

Разным субпопуляциям Тн-клеток приписывают различные функции.

• Взаимодействие с В-клетками для увеличения продукции антител. Такие Т-клетки действуют путем высвобождения цитокинов, которые обеспечивают подачу различных активирующих сигналов В-клеткам. Как указывалось ранее, цитокины являются растворимыми веществами или медиаторами, высвобождаемыми клетками; такие медиаторы, высвобождаемые лимфоцитами, называются лимфокинами. Группе цитокинов с низкой молекулярной массой дали название хемокины. Они, как указывается далее, участвуют в воспалительной реакции.
• Участие в реакциях воспаления. После активации определенная субпопуляция Т-клеток высвобождает цитокины, индуцируя миграцию и активацию моноцитов и макрофагов, что приводит к возникновению так называемых воспалительных реакций гиперчувствительности замедленного типа. Эту субпопуляцию Т-клеток, участвующих в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), иногда называют Тгзт или просто Тн.
• Цитотоксические эффекты. Т-клетки особой субпопуляции становятся цитотоксическими клетками-киллерами, которые при контакте со своей мишенью способны нанести удар, ведущий к гибели клетки-мишени. Эти Т-клетки называют цитотоксическими Т-клетками (Тс). В отличие от Тн-клеток они экспрессируют молекулы CD8 на своих мембранах и поэтому называются СD8+-клетками.
• Регуляторные эффекты. Хелперные Т-клетки могут быть разделены на две различные функциональные подгруппы в соответствии с цитокинами, которые они высвобождают. Как вы узнаете из следующих глав, эти субпопуляции (Тн1 и Тн2) обладают различными регуляторными свойствами, которые передаются посредством высвобождаемых ими цитокинов. Более того, Тн1 -клетки могут негативно перекрестно влиять на Тн2-клетки, и наоборот. У другой популяции регуляторных или Т-клеток-супрессоров отмечается коэкспрессия CD4 и CD25 (CD25 является α-цепью рецептора интелейкина-2. Регуляторная активность этих СD4+/СD25+-клеток и их роль в активном подавлении аутоиммунитета обсуждается в гл. 12.
• Эффекты цитокинов. Т-клетки и другие клетки иммунной системы (например, макрофаги) оказывают различное воздействие на многие клетки, лимфоидные и нелимфоидные, посредством разных цитокинов, которые они высвобождают. Таким образом, прямо или косвенно Т-клетки связываются и взаимодействуют с множеством типов клеток.

В результате многолетних иммунологических исследований было установлено, что клетки, активированные антигеном, проявляют целый ряд эффекторных способностей. Однако только за последние несколько десятилетий иммунологи стали осознавать всю сложность событий, которые происходят при активации клеток антигеном и при их взаимодействии с другими клетками. Мы теперь знаем, что простой контакт Т-клеточного рецептора с антигеном недостаточен для активации клетки.

В действительности для активации антигенспецифичной Т-клетки должны быть даны по крайней мере два сигнала. Первый сигнал обеспечивается связыванием Т-клеточного рецептора с антигеном, который должен быть соответствующим образом презентирован АПК. Второй сигнал определяется участием костимуляторов, среди которых имеются определенные цитокины, такие как IL-1, IL-4, IL-6, и поверхностные молекулы, экспрессированные на АПК, такие как CD40 и CD86.

В последнее время под термином «костимулятор» стали подразумевать и другие стимулы, например продукты жизнедеятельности микроорганизмов (инфекционные, чужеродные) и поврежденная ткань («гипотеза опасности» П. Матзингера (P. Matzinger)), которые будут усиливать первый сигнал, если он относительно слаб. Как только Т-клетки получают достаточно четкий сигнал для активации, происходит ряд событий, и активированная клетка синтезирует и высвобождает цитокины. В свою очередь эти цитокины контактируют с определенными рецепторами на различных клетках и воздействуют на эти клетки.

Хотя обе, гуморальная и клеточная, ветви иммунного ответа рассматриваются как самостоятельные и отличные друг от друга компоненты, важно понимать, что реакция на любой специфический патоген может предусматривать сложное взаимодействие между ними, а также участие элементов врожденного иммунитета. Все это нацелено на обеспечение достижения максимально возможного выживания организма за счет удаления антигена и, как мы увидим далее, защиты организма от аутоиммунного ответа на собственные структуры.

Проявление разнообразия в иммунном ответе

Вкратце эти соображения таковы:

• По различным подсчетам число специфичных антигенов, к которым может возникать иммунный ответ, способно достигать 106-107.
• Если каждый специфичный ответ, как антительный, так и Т-клеточный, определяется одним геном, означает ли это, что каждому индивидууму потребуется более 107 генов (один на каждое специфичное антитело)? Каким образом этот массив ДНК передается неповрежденным от индивида к индивиду?

Природа создала технологию генных рекомбинаций, при которой белок может кодироваться молекулой ДНК, составленной из набора рекомбинируемых (переставляемых) мини-генов, которые и составляют полный ген. На основе небольшого набора таких мини-генов, способных свободно комбинироваться для создания целого гена, можно получить огромный репертуар специфичностей, используя ограниченное число генных фрагментов.

Первоначально этот механизм был призван объяснить существование огромного разнообразия антител, которые не только секретируются В-клетками, но также фактически составляют антиген-или эпитопспецифичные рецепторы В-клеток. Впоследствии было установлено, что подобные механизмы отвечают и за разнообразие антигенспецифичных Т-клеточных рецепторов (TCR).

Достаточно сказать, что существование различных методов молекулярной биологии, позволяющих не только исследовать гены, но и произвольно перемещать их из одной клетки в другую, обеспечивает быстрый дальнейший прогресс в иммунологии.

Р.Койко, Д.Саншайн, Э.Бенджамини

6.3. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основной функцией иммунной системы является контроль за постоянством внутренней среды организма и удаление болезнетворных микробов или чужеродных молекул. В выпол­нении этой функции важная роль принадлежит механизмам врожденного иммунитета. Их называют еще факторами неспецифической защиты, т.к. они защищают организм от различных экзогенных и эндогенных агрессий, а их защитные функции лишены избирательности. К системе врожденного иммунитета относятся фаго­цитарные клетки крови и тканей, натуральные киллеры, а также молекулы, продуцируемые этими клетками (систе­ма комплемента, интерлейкины, интерфероны и др.).

Механизмы специфического иммунного ответа вклю­чаются только после контакта с антигеном, а защита выполня­ется высокоспециализированными клетками иммунной системы. Распоз­навание и элиминацию чужеродных агентов осуществляют лимфоциты (клеточный иммунитет), а также продуцируемые и секретируемые ими антитела - иммуноглобулины (гуморальный иммунитет). Все эти компо­ненты находятся в тесной взаимосвязи; местом их функциональной коо­перации являются органы и ткани иммунной системы организма. В гематологической клинике обычно используются методы изучения гуморального и клеточного иммунитета, а также системы фа­гоцитов.

6.3.1. Изучение гуморального звена иммунитета.

Концентрации иммуноглобулинов классов M, G, A в сыворотке крови, а также секреторного иммуноглобулина А (SIgA) и S-компонентов в слюне и других секретах являются важнейшими параметрами гуморально­го звена иммунной системы. Методы количественной оценки иммуногло­булинов в биологических средах можно разделить на несколько групп в соответствии с принципами, лежащими в их основе: иммунопреципитация в геле, нефелометрия или турбодиметрия, твердофазный иммунофермент­ный анализ и радиоиммуноанализ. Они основаны на сравне­нии концентрации иммуноглобулинов в исследуемом объекте со стан­дартным раствором установленной концентрации.

В иммунологических исследованиях наибольшее распространение получил метод радиальной иммунодиффузии по Манчини. Он основан на том, что при встрече антигена (АГ) и антитела (АТ), относящегося к определенному классу иммуноглобулинов, в агаровом геле происходит их взаимодействие, и образующийся преципитат выпадает в осадок в виде визуально определяемых зон или полос. Диаметр кольца преципи­тации пропорционален концентрации иммуноглобулина. В норме содержа­ние иммуноглобулинов в сыворотке крови составляет: IgG - 13,9±0,64 г/л, IgA - 2,82±0,19 г/л, IgM - 1,18±0,06 г/л.

Лазерная нефелометрия основана на регистрации светового пото­ка, который рассеивается комплексом АГ-АТ, взвешенным в оптически прозрачной среде. Принцип турбодиметрии основан на регистрации света, поглощаемого образовавшимся комплексом АГ-АТ. Большим преимуществом кинетической нефелометрии является быстрота получения результатов (несколько минут; для сравнения: метод Манчи­ни для IgG и IgA - 24 часа, для IgM - 48 часов).

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) в силу своей боль­шой чувствительности применяется для определения в сыворотке минор­ных иммуноглобулинов IgD и IgE, а также для определения всех клас­сов и субклассов иммуноглобулинов в супернатантах культур лимфоци­тов периферической крови, стимулированных В-митогенами: бактериаль­ным липополисахаридом (ЛПС), митогеном растительного происхождения PWM, антителами против иммуноглобулиновых m-цепей.

Недостаточность иммуноглобулинов может быть врожденной или приобретенной. Причинами недостаточности иммуноглобулинов могут быть: дефекты пролиферации, дифференцировки и функций В-лимфоцитов, нарушения регуляции синтеза иммуноглобулинов или переключения на другой изотип, связанные с дефектами Т-хелперов или соответствующих цитокинов, общая недостаточность белкового синтеза, ускорение ката­болизма молекул иммуноглобулинов или их разрушение протеолитически­ми ферментами.

Примером генетического дефекта является агаммаг­лобулинемия Брутона, которая развивается вследствие мутации в гене, кодирующем тирозинкиназу, которая необходима для дифференцировки В-клеток. В ре­зультате предшественники В-лимфоцитов не могут дифференцироваться в зрелые В-лимфоциты. У таких больных отсутствуют зрелые В-лимфоциты, плазматические клетки и нет никаких иммуноглобулинов.

Злокачественная трансформация В-лимфоцитов приводит к селективной пролиферации какого-то одного клона клеток и к продукции антител одного класса и одной специфичности. Такие случаи относятся к моноклональным гаммапатиям и проявляются вариабельными иммунодефицитами. Примером вторичного иммунодефицита, развивающегося вследствие злокачественной трансфор­мации В-лимфоцитов, является множественная миелома, при которой в сыворотке больного появляется большое количество гомогенного бел­ка - моноклонального иммуноглобулина, секретируемого злокачественным клоном В-клеток. Избыток легких цепей иммуноглобулинов, продуцируемых теми же клетками, выводится через почки и выявляется в моче в виде белка Бенс-Джонса.

Нарушение синтеза иммуноглобулинов наблюдается при лимфогранулематозе, неходжкинских лимфомах, хроническом лимфолейкозе. Лечение онкогематологических заболеваний с помощью цитоста­тических препаратов, стероидов, рентгеновского облучения может выз­вать существенное снижение уровня иммуноглобулинов.

6.3.2. Изучение клеточного звена иммунитета.

Для оценки клеточного иммунитета применяется набор иммунологических тестов, среди которых наибольшее расп­ространение получили: 1)определение гиперчувствительности замедленного типа с по­мощью кожных проб; 2)изучение пролиферативной активности лимфоцитов;3) количественная оценка популяций и субпопуляций лимфоцитов;4)определение уровня секретируемых цитокинов; 5)реакция торможения миграции лейкоцитов.

6.3.2.1. Кожные тесты.

Кожные тесты являются аналогом туберкулиновых проб. Так как эти реакции опосредуются Т-лимфоцитами, то в качестве антигенов вы­бираются только Т-зависимые антигены, например, вирус свинки, очи­щенный туберкулин, кандидозный антиген, дифтерийный или столбнячный анатоксин, антиген трихофитона, гемоцианин.

Указанные антигены вводятся внутрикожно, и учет реакции осу­ществляется по величине воспалительного очага через 24-48 часов. Кожный тест является интегральной реакцией, оцени­вающей несколько этапов иммунного ответа (распознавание антигена, хемотаксис, синтез цитокинов). Главным недостатком при проведении этого теста является трудность стандартизации воспалительной реак­ции.

Результаты оценки клеточного иммунитета с помощью кожных проб являются достаточно постоянными как у мужчин, так и у женщин в воз­расте от 16 до 65 лет. С возрастом клеточный иммунитет понижается, что проявляется снижением способности давать положительные реакции. Наблюдается корреляция между кожными пробами и повышенной заболеваемостью (инфекции, злокачест­венные опухоли) или смертностью в определенных группах больных. Поэтому кожные тесты можно рассматривать и как прогностические.

6.3.2.2. Определение пролиферативной активности лимфоцитов.

Определение пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови является важнейшим показателем функциональной активности этих клеток. В качестве Т-клеточных митогенов используются фитогемагг­лютинин (ФГА), конканавалин А (Кон А), В-клеточных - митоген лако­носа (МЛ), а также аллогенные клетки. В качестве специфических ан­тигенов применяются чаще всего РРD, кандидозные антигены, стрепто­киназа-стрептодорназа, дифтерийный и столбнячный анатоксины.

Некоторые Т-митогены реагируют с различными субпопуляциями Т-клеток: Кон А преимущественно активирует Т-супрес­соры, ФГА - Т-хелперы синтеза иммуноглобулинов. При оценке резуль­татов пролиферативного ответа на митогены следует учитывать, что эти агенты являются поликлональными стимуляторами, и положительный результат говорит о том, что регулирующие клетки в организме су­ществуют и могут давать ответ на соответствующий стимул.

В настоящее время для оценки пролиферативного ответа на Т-ми­тогены или аллоантигены используется только радиометрический метод с применением 3 H- и 14 С-меченного тимидина. Стимулированные лимфоциты инкубируются с изотопом в течение 6-24 часов с последующим осаж­дением клеток на специальных фильтрах и учетом реакции бластной трансформации с помощью жидкостных сцинтилляционных b-cчетчиков.

Эта реакция может быть ослаблена Т-клеточных дефицитах (атаксия-телеангиэктазия, генети­чески детерминированная аплазия тимуса - синдром Ди-Джорджи), онкогематологических заболеваниях, особенно в терминальной стадии, вторичных иммунодефицитах.

6.3.2.3. Количественная оценка популяций и субпопуляций лимфоцитов.

Изучение субпопуляций Т-клеток ранее проводилось с по­мощью реакции Е-розеткообразования, основанной на том, что одним из маркеров Т-лимфоцитов является поверхностный гликопротеин - Е-рецептор (в настоящее время обозначается как CD2), способный взаимодействовать с мембранной структурой эритроцитов барана (Е-розеткообразование) и с адгезионной молекулой LFA-3 на эритроцитах человека - ауто-ро­зеткообразование (ауто-РОК). Этот маркер появляется на мембране пред­шественников Т-лимфоцитов в тимусе и сохраняется на зрелых Т-лимфо­цитах в периферической циркуляции. Кластер CD2 обнаруживается на поверхности естественных киллеров (ЕК), лимфокинактивированных киллеров (LAK), имеющих морфологию больших гранулярных лимфоцитов, а также клеток нелимфоидного ряда. Таким образом, реакция Е-розеткообра­зования является показателем суммы перечисленных клеток, несущих антиген CD2. В связи с этим не рекомендуется использовать Е-розеткообразо­вание для идентификации Т-клеток.

Для оценки субпопуляций Т-лимфоцитов ранее использовался так­же теофиллиновый тест, который в настоящее время в связи с низкой специфичностью не применяется.

Развитие современной техники оценки различных субпопуляций лимфоцитов связано с: 1)разработкой и стандартизацией панели моноклональных антител (МАТ) к различным поверхностным дифференцировочным антигенам кле­ток; 2)появлением нового поколения проточно-цитометрического обору­дования; 3)совершенствованием компьютеризированных методов обработки данных.

В настоящее время с помощью МАТ идентифицировано более 165 по­верхностных антигенов лейкоцитов, опреде­лена их молекулярная масса, химическая структура, функция. Дифференцировочные лейкоцитарные антигены обозначаются как "CD" (кластер дифференцировки) и имеют номера, соответствующие хронологии их открытия. Выявляя поверхностные дифференцировочные маркеры, можно оп­ределить популяцию и субпопуляцию клеток, стадию их дифференцировки и активации, функциональную активность и взаимодействие с другими клетками.

Наиболее значимыми поверхностными маркерами являются: для оп­ределения зрелых Т-лимфоцитов - CD3, Т-хелперов/индукторов - CD4, Т-цитотоксических/супрессоров - CD8, естественных киллеров (NK) - СD16, CD56 и СD57, маркеров ранней активации - CD25, CD71, HLA-DR. Определение поверхностных иммуноглобулинов продолжает оставаться одним из главных методов идентификации В-лим­фоцитов. Надежным методом их определения является также выявление CD19, CD20 и CD22 с помощью МАТ.

Лучшим методом выявления поверхностных маркеров является проточная цитометрия, сущность которой заключается в определении гетерогенности популяций клеток по экспрессируемым маркерам клеточ­ной поверхности. В гематологической клинике основными задачами проточной цитометрии являются: 1)иммунофенотипирование лейкозов и лимфом; 2)анализ распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия); 3)иммунофенотипирование лимфоцитов, оценка внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями; 4)анализ процессов активации и пролиферации клеток иммун­ной системы; 5)выявление и мониторинг минимальной остаточной болезни.

Иммунофенотипирование острых лейкозов.

Иммунофенотипирование острых лейкозов с помощью проточной цитометрии проводится в два этапа: сначала определяется разновидность лейкоза (В- или Т-острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз), затем подварианты заболевания (В 1 -В 5 -варианты В-клеточного, Т 1 -Т 4 -варианты Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, М0-М7 варианты острого миелоидного лейкоза) - таблицы 6.3.1-6.3.4.

Таблица 6.3.1.

Панель маркеров для проведения первого этапа иммунофенотипирования.

Таблица 6.3.2.

Иммунологическая классификация В-линейных острых лимфобластных лейкозов.

Обозначения: cy - цитоплазматическая экспрессия антигена; s - поверхностная экспрессия антигена; +/- большинство позитивных случаев; + позитивный; - не­гативный.

Таблица 6.3.3.

Иммунологическая классификация T-линейных острых лимфобластных лейкозов.

Обозначения: cy - цитоплазматическая экспрессия; s - поверхност­ный;

+/- - большинство позитивных случаев; -/+ - большинство нега­тивных случаев; + - позитивный; - негативный.

Таблица 6.3.4.

Цитохимические, цитогенетические и иммунофенотипические свойства острых миелоидных лейкозов

Сокращения: Glyc.A - гликофорин; MП - миепероксидаза; СЭ - специфическая эстераза; НСЭ - неспецифическая эстераза.

Определение уровня секретируемых цитокинов

Главным методическим подходом для определения способности Т-лимфоцитов и других клеток продуцировать цитокины является их ак­тивация различными стимуляторами: например, Т-клеток - Т-митогенами (ФГА, Кон А), макрофагов - липополисахаридом энтеробактерий с иден­тификацией в супернатантах соответствующих цитокинов. Для этих целей могут использоваться биологические (применение чувс­твительной к данному цитокину линии клеток), иммуноферментные и ра­диоиммунные методы. Наиболее перспективными являются иммунофермент­ные методы, основанные на применении моноклональных антител к двум различным эпитопам цитокина.

Реакция торможения миграции лейкоцитов

Реация торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) основана на спо­собности Т-лимфоцитов, специфичных к данному антигену, при взаимо­действии с ним синтезировать совокупность цитокинов, ак­тивирующих фагоцитарные клетки. Одним из проявлений этого процесса является ингибиция миграционных свойств лейкоцитов. Данное свойство играет важную роль в защите организма от чужеродных аген­тов, так как способствует накоплению фагоцитарных клеток в воспали­тельном очаге. Определение фактора, ингибицирующего миграцию (MIF), оказалось ценным тестом для оценки функциональной активности Т-лим­фоцитови и специфической сенсибилизации. В связи с развитием учения о цитокинах стало ясно, что именно они осуществляют актива­цию и ингибицию движения фагоцитарных клеток, причем главным дейс­твующим фактором в этой активации является g-интерферон. РТМЛ можно использовать для оценки как интенсивности хемотаксиса (миграционной способности) лейкоцитов при различных заболеваниях иммунной системы, так и для выявления клеточного иммунитета к различным антигенам и аутоантигенам.

Исследование функции фагоцитирующих клеток.

Процесс фагоцитоза состоит из ряда последовательных и взаимос­вязанных стадий. К ним относятся подвижность, хемотаксис, адгезия, поглощение, дегрануляция, образование активных форм кислорода и азота, киллинг и расщепление объекта фагоцитоза.

Определение хемотаксиса лейкоцитов проводят методом миграции в микрофильтрационных камерах или в агарозном геле под влиянием различных хемотаксических факторов (хемоатт­рактантов), к которым относятся некоторые N-формилпептиды бактери­ального просхождения, компоненты комплемента (С3a и С5a), лейкотри­ены, тромбоцитактивирующий фактор, ИЛ-8 и т.д. Все эти ве­щества могут накапливаться в воспалительном очаге и оказывать влия­ние на движение фагоцитов.

Изучение синтеза и экспрессии адгезионных молекул.

За адгезивные свойства нейтрофилов и моноцитов отвечают их по­верхностные рецепторы, называемые селектинами и интегринами. С по­мощью селектинов фагоциты “катаются” по поверхности эндотелиальных клеток перед их твердым прикреплением с помощью интегринов к этой поверхности.

А. Исследование гуморального иммунитета

1. Определение числа B-лимфоцитов. На клеточной мембране лимфоцитов находится множество гликопротеидов, которые можно обнаружить при проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител. Некоторые из этих гликопротеидов специфичны для определенного типа клеток, например T-, B- и NK-лимфоцитов, разных субпопуляций T-лимфоцитов, моноцитов, и даже для определенных стадий их созревания и дифференцировки. Эти молекулы принято обозначать CD. В настоящее время определены функции многих CD (см. табл. 18.8). При оценке результатов исследования необходимо учитывать возраст больного. Кроме того, необходимо постоянно контролировать качество реактивов и соблюдение методики, поскольку даже незначительное ее нарушение искажает результаты исследования. Определение B-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии основано на выявлении иммуноглобулинов, фиксированных на поверхности клеток, CD19 и CD20 (см. табл. 18.8). У детей старшего возраста и взрослых B-лимфоциты составляют 10-20% всех лимфоцитов крови, у детей младшего возраста их больше.

2. Определение титра антител. При подозрении на недостаточность гуморального иммунитета оценивают титр антител к белковым и полисахаридным антигенам. Обычно их определяют после вакцинации или инфекции.

а. Антитела к белковым антигенам. В большинстве случаев исследуют IgG к дифтерийному и столбнячному анатоксинам до и спустя 2-4 нед после вакцинации АКДС или АДС. Поскольку почти все взрослые вакцинированы АКДС, уровень антител после ревакцинации служит показателем вторичного иммунного ответа. Можно определить также антитела к антигену PRP после введения вакцины против Haemophilus influenzae типа B. Хотя этот антиген представляет собой полисахарид, в конъюгированной вакцине он действует как белковый антиген. Иногда исследуют антитела после иммунизации инактивированной вакциной против полиомиелита и рекомбинантной вакциной против гепатита B. При подозрении на иммунодефицит живые вирусные вакцины противопоказаны.

б. Антитела к полисахаридным антигенам. Для оценки гуморального иммунного ответа на полисахаридные антигены применяются пневмококковая и менингококковая вакцины, не содержащие белковых носителей. Титр антител определяют до и спустя 3-4 нед после вакцинации. В некоторых исследовательских лабораториях для этих целей используют неконъюгированную вакцину против Haemophilus influenzae типа B. Результаты оценивают с учетом возраста больного. Так, у детей младше 2 лет иммунный ответ на полисахаридные антигены слабый, у некоторых детей он остается таковым вплоть до 5 лет. В связи с этим применение полисахаридных вакцин у детей младшего возраста нецелесообразно и даже противопоказано, поскольку может привести к иммунологической толерантности и неэффективности ревакцинации в более старшем возрасте.

в. Оценка первичного и вторичного гуморального иммунного ответа. Для определения клиренса антигена, уровня IgM (при первичном иммунном ответе) и IgG (при вторичном иммунном ответе) в качестве белкового антигена используют бактериофаг фихи 174 - бактериальный вирус, безопасный для человека. Для оценки первичного гуморального иммунного ответа применяют также гемоцианин брюхоногих моллюсков, рекомбинантную вакцину против гепатита B, мономерный флагеллин, вакцину против клещевого энцефалита.

г. Естественные антитела (изогемагглютинины, антитела к стрептолизину O, гетерофильные антитела, например антитела к эритроцитам барана) в норме присутствуют в сыворотке почти всех людей. Это объясняется тем, что антигены, против которых направлены эти антитела, широко распространены и содержатся в пищевых продуктах, вдыхаемых частицах, микрофлоре дыхательных путей.

3. Определение подклассов IgG. Если при рецидивирующих бактериальных инфекциях дыхательных путей общий уровень IgG в норме или незначительно снижен или выявляется изолированный дефицит IgA, показано определение подклассов IgG. При этом можно обнаружить дефицит IgG 2 (IgG 2 составляет около 20% IgG), который может быть изолированным или сочетаться с дефицитом IgA или IgG 4 . Следует помнить, что функциональная оценка гуморального иммунного ответа - более информативный метод исследования, чем количественное определение подклассов IgG. Так, при нормальном уровне IgG 2 часто бывает снижен уровень антител к полисахаридным антигенам Streptococcus pneumoniae. Наряду с этим возможен врожденный дефицит IgG 2 , обусловленный нарушением синтеза тяжелых цепей, в отсутствие каких-либо клинических проявлений иммунодефицита.

4. Определение IgA. Изолированный дефицит секреторного IgA при нормальном уровне IgA в сыворотке встречается редко. Как правило, наблюдается одновременный дефицит секреторного и сывороточного IgA. Изолированный дефицит IgA клинически не проявляется или сопровождается легкими инфекциями верхних дыхательных путей. Это обусловлено тем, что при дефиците IgA компенсаторно повышается уровень IgG в сыворотке и IgM в секрете слизистых. Уровень IgA измеряют в слезе, слюне и других биологических жидкостях. Существует два подкласса IgA - IgA 1 и IgA 2 . В крови и секрете дыхательных путей преобладает IgA 1 , в секретах ЖКТ - IgA 2 . Нормальные показатели уровней IgA 1 и IgA 2 .

5. Синтез иммуноглобулинов in vitro. Это исследование позволяет оценить выработку IgM, IgG и IgA стимулированными B-лимфоцитами. Смешивая обработанные разными стимуляторами T- и B-лимфоциты здоровых и больных, можно оценить функцию T-хелперов и B-лимфоцитов. В большинстве случаев дефицит антител обусловлен нарушением дифференцировки B-лимфоцитов в плазматические клетки.

6. Биопсию лимфоузлов при подозрении на первичный иммунодефицит, как правило, не производят. Она показана лишь в тех случаях, когда диагноз неясен и у больного увеличены лимфоузлы, что требует исключения гемобластоза. Биопсию обычно производят через 5-7 сут после антигенной стимуляции. Антиген вводят в область, лимфа от которой оттекает в группу лимфоузлов, один из которых подлежит биопсии. При недостаточности гуморального иммунитета в лимфоузле снижено число плазматических клеток, количество первичных фолликулов увеличено, вторичные фолликулы отсутствуют, толщина коркового вещества уменьшена, наблюдается перестройка ткани лимфоузла, иногда увеличивается число макрофагов и дендритных клеток.

ООО "Медис КоМ", врач-консультант О.И. Вострикова, 2003
Традиционные методы клинико-иммунологических исследований разделяют на методы оценки клеточного и гуморального иммунитета.
В современной практике клинико-иммунологических исследований основным объектом анализа является кровь – как ее клеточные компоненты, так и сыворотка. В настоящее время в поле внимания иммунологов наряду с мононуклеарной фракцией все чаще оказывается фракция гранулоцитов.
Сегодня иммунологи практически полностью отказались от методов, основанных на розеткообразовании. Это были первые методы, которые позволили определять Т- и В-лимфоциты человека в период, когда отсутствовали необходимые антитела для выявления этих клеток. Число недостатков у этих методов достаточно велико: неоднозначность трактовки результатов (они зависят от условий постановки реакции, качества реагентов, определяются состоянием не только маркерных молекул, но и цитоскелета и др.), трудности, связанные с их стандартизацией и автоматизацией. Проблему определения субпопуляций удалось решить после внедрения проточной цитофлуориметрии и появлением широкого спектра моноклональных антител к маркерным молекулам иммуноцитов.
Цитофлуориметрический анализ может быть представлен следующим образом:
Клетки обрабатываются моноклональными антителами к их мембранным антигенам, коньюгированными флуорохромами. В случае одновременного изучения нескольких маркерных антигенов используют мечение флуорохромами, контрастными по цвету. Клетки, обработанные мечеными антителами, пересекают луч лазера и генерируют различные сигналы (от прямого и бокового светорассеяния и от свечения различных флуорохромов), которые регистрируются и анализируются прибором. Результаты компьютерного анализа выражаются в виде одно- и двухпараметрических гистограмм, отражающих распределение клеток по интенсивности свечения одного или двух флуорохромов. Результаты выражают в процентах меченых клеток и средней интенсивностью свечения. В случае использования двух флуорохромов учитывают процент клеток, меченных каждым типом флуорохрома и обоими красителями одновременно.

Оценка нарушений естественного иммунитета

При лабораторной оценке нарушений естественного иммунитета, как правило, определяют фагоцитарную активность или генерацию метаболически активных радикалов и оценивают состояние системы комплемента.
Хотя определение показателей фагоцитоза (фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) с помощью микроскопического подсчета фагоцитирующих клеток и фагоцитированных объектов является методически корректным, существуют модификации метода, позволяющие стандартизировать и автоматизировать регистрацию его результатов. Например, фагоцитоз частиц латекса, меченных флуорохромом, что дает возможность регистрировать результаты цитофлуориметрически.

Широко распространен метод оценки активности фагоцитирующих клеток по восстановлению нитросинего тетразолия. Результаты определения позволяют оценить генерацию формазана по появлению синего окрашивания. Аналогичный результат дают люминесцентные методы регистрации образования метаболически активных форм кислорода и свободных радикалов методами регистрации хемилюминесценции, усиливаемой люминофорами (люминолом и люцигенином).
Ранее состояние системы комплемента оценивали с использованием громоздкой гемолитической системы. В настоящее время стало доступным определение факторов комплемента методом ИФА

Оценка гуморального звена

Определение факторов гуморального иммунитета включает подсчет В-лимфоцитов в периферической крови, определение концентрации иммуноглобулинов основных классов, а в особых случаях субклассов IgG. Адекватными тестами на B-лимфоциты является их цитофлуориметрическое определение с использованием поликлональных антител к общим детерминантам иммуноглобулинов или моноклональных антител к одному из пан-В-клеточных маркеров, чаще всего CD19, 20 или 72. Методом двойной иммунофлуорисценции с использованием антител к CD19 и 5, меченных разными флуорохромами, в специальных случаях определяется субпопуляция В1.

Концентрацию IgM, IgG, IgA, а также типы легких цепей иммуноглобулинов обычно определяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, с использованием поликлональных антител. Однако в особых случаях для этого используют иммуноферментные (обычно иммуносорбентные) тест-системы и моноклональные антитела. Изотипы IgG определяют исключительно с помощью иммуноферментных тест-систем и моноклональных антител. Определение IgE проводят радиоиммунным и иммуноферментным методами в рамках аллергологического обследования.

Оценка клеточного звена

Маркеры В-клеток: CD 19 + , CD20 + , CD 72 +
Субпопуляция В1: СD19 + CD5 +
“Наивные” Т-клетки: CD45RA +
Т-клетки памяти: CD45RO +
Т-хелперы: CD3 + CD4 +
Индукторы хелперов: CD4 + CD29 +
Цитотоксические (киллерно-супрессорные) лимфоциты: CD3 + CD8 +
Индукторы супрессоров: CD4 + CD45RO +
Субпопуляция прекиллеров: CD8 + CD11b +
Предшественники супрессоров: CD8 + Leu7
Классические NK-клетки: CD56 + CD57 +
БГЛ (субфракция К-клеток): СD16 + CD3 -
Эффекторы антителзависимой клеточной цитотоксичности (естественные киллеры, обладающие активностью К-киллеров): CD56 + CD16 +
NKT-клетки (T-лимфоциты с активностью неспецифических киллеров): CD3 + CD56 + /CD16 +

Митогенная стимуляция

В качестве Т-клеточных митогенов применяют фитогемагглютинин (ФГА), реже конканавалин А (КонА).
В качестве В-клеточного митогена – бактериальный липополисахарид.
Для индукции тимусзависимого гуморального ответа (осуществляют В-клетки при участии Т-хелперов) используют митоген лаконоса.

При всех вариантах митогеной стимуляции регистрируется пролиферативный ответ клеток. Выход клеток в цикл и процент клеток, находящихся в фазе S, можно регистрировать методом проточной цитометрии. При этом выявляется содержание в клетках ДНК, оцениваемое по окрашиваемости йодидом пропидия. Формирование пика тетраплоидных клеток означает переход части клеток в S/G2-фазу клеточного цикла. Ответ В-лимфоцитов на митоген лаконоса может регистрироваться также по синтезу иммуноглобулинов различных классов методом ИФА.

Определение цитокинов в биологических жидкостях

Все шире распространяются методы определения цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях (например, ИЛ-1 и ИЛ-6, ФНОα в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите), а также в супернатантах культур стимулированных клеток (моноцитов, макрофагов или лимфоцитов). Этот подход позволяет не только оценить уровень соответствующих цитокинов, он дает возможность сопоставить активность двух типов Т-хелперов – Th1 и Th2, что должно в значительной степени обуславливать тактику иммуномодулирующих воздействий. Для определения Th1- и Th2-лимфоцитов требуются предварительное культивирование в присутствии ИЛ-2 (12-15 сут) и клонирование пролиферических клеток. Предобразованные клетки определяют цитофлуометрически с помощью моноклональных антител к ключевым цитокинам (ИФНγ и ИЛ-4), выявляя эти цитокины в цитоплазме клеток.

Однако определение цитокинов пока дорого, и кроме того имеется существенный недостаток, свойственный большинству функциональных тестов, - необходимость культивирования клеток в стерильных условиях. Методы определения цитокинов в биологических тест-системах (костимуляция тимоцитов, поддержание роста клеточных линий, зависимых от цитокинов) едва ли имеют перспективы практического использования из-за громоздкости и неспецифичности.

Методы оценки антигенспецифического иммунного ответа

in vitro: определение в сыворотке титров естественных изоагглютининов и антител к распространенным микроорганизмам,
in vivo: постановка кожных проб; внутрикожные тесты, которые позволяют выявить ответ организма на гаптены, вызывающие контактную гиперчувствительность (динитрохлорбензол), распространенные антигены (кандидозный антиген, стрептокиназа-стрептодорназа, туберкулин и др.) или митогены (ФГА).
Такие тесты весьма информативны, поскольку отражают реальное состояние клеточного звена иммунной системы, но их недостатком являются инвазивность и временные затраты.
Наиболее важной задачей клинических иммунологов является строгое отношение к трактовке результатов лабораторных иммунологических тестов и отказ от явно устаревших методических подходов, особенно при наличии доступных современных методов.
__________________________________________________
Перепечатка материалов возможна только с указанием авторства и указанием активной ссылки